细胞生物学实验指导

细胞生物学实验课程介绍

细胞生物学是高等院校生命科学的主要课程之一，是一门实验性很强的学科。细胞生物学实验课是理论教学的重要补充。细胞生物学实验课的教学目的主要是，通过基本技能训练及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手能力、提高学生发现、分析和解决问题的能力。

参考书目：细胞生物学实验（第二版）杨汉民主编 高等教育出版社

细胞生物学实验（第二版）李芬、胡海燕主编 科学出版社

细胞生物学（第五版）丁明孝等主编 高等教育出版社

实验室规则与操作要求

为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。

（一）显微镜的使用及保护

1. 显微镜是细胞生物学实验的主要观察工具，使用时必须注意保持外观整洁、防湿、防高温、防药品侵蚀，使用时勿使染液或其它溶液沾污镜头，一旦沾污，及时用擦镜纸蘸上镜头清洗液（无水乙醚：无水乙醇＝7：3）轻轻擦拭干净。

2. 带光源的显微镜待电压稳定后，将电源的光亮度调节器调至最小，再打开显微镜的电源，缓慢调节光亮度适当进行量度观察，观察完毕后，则先将光亮度调节器调至最小，然后再关闭显微镜电源开关。

3. 镜头的清洗：实验完毕后，镜头的清洗很重要。用擦镜纸蘸取少量镜头清洗液，先从镜头的中央开始清洗，轻轻旋转擦至镜头的边缘部分，如此重复2－3次。

4. 载物台必须保持清洁，必要时亦可用擦镜纸蘸少量清洗液擦试载物台。聚光器上的污物的去除亦可采用类似的方法。

5. 使用完毕后，玻片一律取下，套上布袋放回原处。本桌的显微镜一律不准搬离本实验桌。若需使用者，可到该桌使用，使用后务必保持该显微镜的清洁。

如若发现违章使用情况，必追究使用者责任，本次实验作零分计。

（一）实验时，实验室内，一律不准高声喧哗整洁，保持室内安静，认真操作，仔细做好各项观察与记录。

（二）实验室内的一切仪器、物品必须爱护。节约材料、药品，取用时不要过量。公用物品不得独自占用，用后归还原处。

（三）注意安全。使用有毒物品、强酸、强碱等，应严格按照操作规程。易燃物品远离火源。禁止湿手拿取电源开关或接触电源。如发生触电等事故，及时报告。

（四）取用各种试剂，要用及时盖上瓶盖。按献宝取出所需之药品或溶液后，不得将原液倒回瓶内。滴管、玻棒、吸管不可混用。

（五）实验中如有丢失、损坏仪器设备及用具，及时登记并报告，凡违反操作规程造成不应有的损失者，视其情节轻重，态度好坏，按有关规定处理。

（六）本实验室欢迎各位实验者对每一实验本身提出新的看法与做法，至于能否采用，视具体情况而定。任何人未经老师许可，不得自作主张，改动任何实验步骤与操作方法。

（七）实验完毕后，须摆齐药品，洗净器皿，做好实验桌清洁。整个实验室清洁由本班班长安排。离开前要关好门、窗、水、电。

目 录

实验一 细胞膜的通透性实验.................................................................. 1

实验二 细胞的凝集实验.......................................................................... 3

实验三 动物细胞的融合实验.................................................................. 5

实验四 植物细胞骨架的光学显微镜观察............................................... 7

实验五 线粒体的超活染色...................................................................... 9

实验六 植物染色体标本的制备及有丝分裂过程的观察...................... 11

实验七 细胞器和亚细胞组分的分离及观察......................................... 13

实验八 氧电极法测定植物的光合和呼吸速率..................................... 17

实验九 DNA的Feulgen染色观察........................................................ 23

实验十 液泡系的活体染色观察............................................................. 25

实验十一 植物组织培养及愈伤组织的分化诱导................................. 27

实验十二 小鼠骨髓间充质细胞的分离培养及观察............................. 31

实验一 细胞膜的通透性实验

一、实验目的

1. 了解动物细胞膜的特性

2. 掌握观察细胞膜通透性的原理和方法

二、实验原理

动物细胞膜是具有流动性、半通透性的双膜结构，有些小分子能自由通过如水分子，而有些小分子不能自由透过如钠离子，钾离子、蔗糖等。水是地球上大部分生命物质存在的基础，水能自由通过细胞膜。钠离子是阳离子不能自由通过，水与细胞接触时，细胞外钠离子浓度低于细胞，细胞内为高渗状态，水分子自由进入红细胞，细胞吸水膨胀，最后细胞膜破裂。高渗的NaCl水溶液与红细胞接触，红细胞相对于溶液处于低渗状态，细胞内水分子自由出细胞，细胞缩水。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器及用具：显微镜、天平、载玻片、盖玻片、滴管、小烧杯、离心管；镊子、吸水纸、擦镜纸、吸管、烧杯、量筒、冰箱。

2.材料：鸡血（采血）

3.试剂：氯化钠，氯化钾，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠

（1）PBS缓冲液

称取7.2g NaCl，1.48 g NaH₂PO₄， 0.46 g KH₂PO₄，用蒸馏水定容至1000 ml，调pH为7.2。

（2）0.9% NaCl

称取0.9 g NaCl，加水定容至100 ml。

（3）饱和NaCl

称取36 g NaCl，加水定容至100 ml。

四、实验方法与步骤

（1）用PBS充分洗涤新鲜采集的鸡血， PBS洗涤3次以上，除去血液中的纤溶蛋白，离心后细胞沉淀用0.9% NaCl溶液稀释成0.5%血细胞。

（2）准备纯净水，0.9%和饱和NaCl溶液

（3）取3片载玻片，分别滴入一滴鸡血红细胞。

（4）在鸡血滴上分别滴加一滴不同溶液，轻轻混匀，10 min后，盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞形态变化。

五、注意事项

1.从离心机内拿出离心管时切勿振荡，不要倾倒离心管倒上清，以免红细胞流出。清洗红细胞时用移液器缓缓吹打，防止红细胞破裂。

2.红细胞悬液放置一段时间会发生沉降，取用之前应当轻轻摇匀。

六、结果与分析

1.观察不同浓度盐水下细胞膜的变化，同时分析其中的原因

实验二 细胞的凝集实验

一、实验目的

1.了解植物凝集素的本质；

3. 掌握细胞凝集的原理和方法。

红细胞凝集：红细胞凝集包括由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的三种类型的细胞凝集现象。

凝集素（lectin）是从各种植物的种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖蛋白，因为能凝集红细胞，故名凝集素。

凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞表面的糖基。通过与细胞表面的糖分子相连，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞的凝集。一种凝集素只对某一种特异的糖基具有特异结合的能力，如马铃薯凝集素专一结合的是N-乙酰氨基葡萄糖二聚体和N-乙酰氨基半乳糖。加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集作用。

另外，凝集素还具有多价结合的能力，能与荧光素、酶生物素、铁蛋白、胶体金结合而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器及用具：显微镜、天平、载玻片、盖玻片、滴管、小烧杯、离心管；镊子、解剖针、刀片、吸水纸、擦镜纸、吸管、烧杯、量筒、恒温水浴锅、冰箱。

2.材料：土豆块茎，鸡（采血）

3.试剂：

（1）PBS缓冲液

称取7.2g NaCl，1.48 g NaH₂PO₄， 0.46 g KH₂PO₄，用蒸馏水定容至1000 ml，调pH为7.2。

（2）0.9% NaCl

称取0.9 g NaCl，加水定容至100 ml。

四、实验方法与步骤

1. 凝集素的制备：

用天平称取2 g去皮土豆块茎，加10 ml PBS缓冲液，在烧杯中浸泡2 h，浸出的粗提液中即含有土豆凝集素。

2. 5%鸡血红细胞的制备：

A. 无菌方法取鸡血于烧杯中，加入抗凝剂，轻轻搅拌，防止血凝；

B. 用1.5 ml的离心管取血液1 ml，2000 rpm，离心5 min，用移液器轻轻吸取上清去除，加入1 ml生理盐水水洗5次。

C. 在小试剂瓶中加入9.5 ml生理盐水，用移液器吸取500 μl血红细胞加入小试剂瓶中，混匀，即是5%的红细胞悬液。贴上标签备用。

3.凝集反应现象：

用滴管吸取红细胞悬液，在两片载玻片上各滴一滴，其中一片加一滴土豆凝集素，一片加一滴PBS缓冲液（对照），充分混匀。静止20 min。盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察血细胞凝集现象。

五、注意事项

1.从离心机内拿出离心管时切勿振荡，不要倾倒离心管倒上清，以免红细胞流出。清洗红细胞时用移液器缓缓吹打，防止红细胞破裂。

2.红细胞悬液放置一段时间会发生沉降，取用之前应当轻轻摇匀。

六、结果与分析

1.绘制加土豆凝集素和PBS缓冲液后红细胞的变化图，并发生凝集的分析原因。

实验三 动物细胞的融合实验

一、实验目的

1.了解PEG诱导动物细胞融合的原理；

2.掌握PEG诱导动物细胞融合的方法。

二、实验原理

PEG的水溶性强，在液相介质中，其分子表面的醚键带有微弱的负电荷，在Ca²⁺离子的参与下，可将带正电的表面蛋白或带负电荷的糖蛋白通过Ca²⁺桥相连，从而使细胞发生聚集、融合。在50%PEG中，自由水消失，可导致细胞脱水而引起质膜结构变化和细胞融合。

PEG用于细胞融合中的优点为：通用性强，可用于动、植物和微生物各种细胞；比仙台病毒等易制备和控制；活性稳定，使用方便。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器及用具：显微镜、天平、载玻片、盖玻片、滴管、小烧杯、离心管；吸水纸、擦镜纸、吸管、烧杯、量筒、恒温水浴锅、冰箱。

2.材料：鸡血（采血）

3.试剂：PEG（MW 4000），葡萄糖，柠檬酸钠，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，酚红

（1）PBS缓冲液

称取7.2g NaCl，1.48 g NaH₂PO₄， 0.46 g KH₂PO₄，用蒸馏水定容至1000 ml，调pH为7.2。

（2）ALsever液：葡萄糖 2.05 g，柠檬酸钠0.8 g，氯化钠 0.42 g，加无菌双蒸水至100 ml

（3）GKN液氯化钠 18 g，氯化钾 0.4 g，7水磷酸氢二钠1.77 g，2水磷酸二氢钠 0.69 g，葡萄糖 2 g，酚红 0.01 g

（4）50%聚乙二醇：称取PEG 10 g放入试管，在100 ℃中水浴完全溶解，温度降至50 ℃，加入等体积50 ℃预热的GKN液，震荡混匀。

四、实验方法与步骤

（1）鸡血混悬液制备

抽取鸡血2 ml，缓慢加入8 ml Alsever液中混匀备用。

（2）实验时吸取1 ml鸡血混悬液，加入4 ml 0.85%生理盐水，1200 rpm 离心5 min 血细胞沉淀，弃上清，再次用相同的方法制作细胞悬液，1000 rpm离心8 min，用血球计数板计数，调整细胞数量为1×10⁷个/ml，（红细胞计数：5个小方格细胞数量×5×稀释倍数×10⁴ /ml），吸取调整的细胞1 ml，在37 ℃中水浴滴加1 ml 50% PEG，边滴边摇匀，加入结束后静置1 min，取 1 ml融合的细胞显微镜下观察其形态。

五、注意事项

滴加PEG时要边滴边轻轻摇匀。

六、结果与分析

实验四 植物细胞骨架观察

一、实验目的

1. 了解细胞骨架的结构特征；

2. 掌握细胞骨架样品制备技术。

二、实验原理

细胞骨架染色：细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用。用适当浓度的Triton X-100处理细胞，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，这就是细胞骨架。

三、实验用品

1. 材料：洋葱鳞茎

2. 试剂：

(1) 6 mmol/L（pH6.8）磷酸缓冲液（用NaHCO₃调PH）。

(2) M缓冲液：50 mmol/L 咪唑、50 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgCl₂、1 mmol/L EGTA[乙二醇双（α-氨基乙基醚）四乙酸]、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇）。

(3) 1%Triton X-100，用M缓冲液配制。

(4) 0.2%考马斯亮蓝R250，其溶剂为：甲醇46.5 ml、冰醋酸7 ml、蒸馏水46.5 ml。

(5) 3%戊二醛，用（1）液配制

四、实验内容

1. 撕取洋葱鳞茎内表皮（约1cm²大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50 ml烧杯中，使其下沉。

2. 吸去磷酸缓冲液，用1% Triton X-100处理20-30 min。

3. 吸去Triton X-100，用M缓冲液洗3次，每次10 min。

4. 3%戊二醛固定0.5-1 h。

5. pH6.8磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min。

6. 0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30 min。

7. 用蒸馏水洗1或2次，细胞置于载玻片上，加盖波片，于普通光学显微镜下观察

五、结果与分析

1. 绘出植物细胞骨架结构图.

实验五 植物线粒体的超活染色

一、实验目的

1. 观察植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布；

2.学习线粒体的超活染色技术。

二、实验原理

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织特异性着色但又对活样品没有毒害作用的一种活体染色方法，它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。

詹纳斯绿B专一用于线粒体的染色，它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合，该酶使染料保持氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

三、实验仪器、材料和试剂

1. 仪器及用具：显微镜、天平、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、解剖针、刀片、吸水纸、擦镜纸、吸管、烧杯、量筒、恒温水浴锅、冰箱。

2. 材料：洋葱鳞茎

3. 试剂：

（1）1/5000詹纳斯绿B溶液（装入棕色滴瓶）

称取50 mg詹纳斯绿B溶于5 ml Ringer溶液中，稍加热（30～40℃），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液1ml加入49 ml Ringer溶液，即成1/5000工作液，装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。

四、实验方法与步骤

1. 吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15分钟。

2. 用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，盖上盖玻片进行观察。

3.

五、注意事项

在对植物进行观察时一定要让材料尽量展开。

六、结果与分析

绘制洋葱鳞茎内表皮细胞中线粒体形态与分布。

实验六 植物染色体标本的制备及有丝分裂过程的观察

一、实验目的

1. 了解有丝分裂的基本过程及生物学意义；

2. 掌握有丝分裂过程中各个时期的主要特点；

3. 掌握常规压片法制备植物染色体标本的基本原理和方法。

二、实验原理

细胞周期是生长与繁殖的周期，每个生物体通过细胞分裂才能达到生长与繁殖的目的。细胞分裂对生物体的个体维持与种族绵延有着十分重要的意义。有丝分裂是高等生物体细胞增殖的主要方式。有丝分裂过程包括一系列复杂的核的变化、染色体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到每个体细胞的过程。有丝分裂是一个连续的过程，按先后顺序可划分为间期、前期、中期、后期和末期五个阶段，但各阶段之间没有明显的界限，是一个连续变化的过程。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器及用具：显微镜、恒温水浴锅、冰箱、天平、温度计、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸、擦镜纸、吸管、烧杯、量筒。

2.材料：蚕豆根尖

3.试剂：

(1) Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）。

(2) 1mol/L HCl取82.5 ml密度1.19 g/ml的浓盐酸加蒸馏水至1000 ml。

(3) 95%、85%、70%乙醇

(4) 改良苯酚品红染色液

原液A：取3 g碱性品红，溶于100 ml的70%乙醇中（此液可置于4℃冰箱中长期保存）。

原液B：原液A 10 ml，加入90ml的5%苯酚水溶液（限2周内使用）。

原液C：取原液B 45ml，加入6 ml冰乙酸和6 ml 37%甲醛（可长期保存）。

染色液：取原液C 10 ml，加 90 ml 45%的乙酸和1.8 g山梨醇（山梨醇为助渗剂兼有稳定染色液的作用），此液即为改良苯酚品红染色液。此液放置两周以后染色效果好。

四、实验方法与步骤

蚕豆根尖细胞有丝分裂的临时压片观察

1.材料发根：待蚕豆根长2cm时，切下根尖，浸入Carnoy固定液中4小时，分别在95%和85%乙醇中浸泡30分钟，最后在70%乙醇中4℃保存；

2.水解：取出根尖放在1mol/L HCl中60℃水解8分钟，然后用蒸馏水洗3次；

3.染色：把处理好的根尖放在载玻片上，切去乳白色的分生区（0.1~0.5 mm），用镊子轻轻捣碎，滴一滴改良苯酚品红染色液，染色30 min，盖上盖玻片；

4.压片：在盖玻片上铺上吸水纸，固定好盖玻片，用大拇指垂直压片，再用橡皮轻轻敲击，将材料压成均匀的薄层；

5.镜检：先用低倍镜寻找压片中处于分裂期的细胞，再转到高倍镜下观察不同分裂时期的细胞。

五、结果与分析

蚕豆根尖细胞有丝分裂各个时期特征：

间期：主要活动是DNA复制和有关蛋白质合成。细胞核内染色质均匀分布，核形态明显，核内可见1-3个透明发亮的核仁；

前期：细胞核膨大，染色质浓缩成染色丝，并逐渐缩短变粗，形成具有一定形态的染色体。晚前期，核膜、核仁逐渐消失；

中期：染色质更加缩短变粗，排列在细胞的中央形成赤道板。这时染色体已纵裂成两条染色单体，但着丝粒未分裂；

后期：着丝粒纵裂，姐妹染色单体被纺锤丝牵引着分别向细胞两极移动。

末期：移到两级的染色体解螺旋、伸长变细成为染色丝，最后形成染色质。核膜和核仁重新出现，形成新的细胞核，纺锤体消失，在原来赤道板的位置出现细胞板，细胞板向四周延伸成为新的细胞壁，形成两个子细胞。

六、注意事项

1. 水解是本实验成败的关键之一，务必控制好时间。

2. 压片、敲片时力量要均匀合适，避免弄碎玻片。

七、作业

1.绘制蚕豆根尖有丝分裂各时期细胞。

实验七 细胞器和亚细胞组分的分离

一、实验目的

1. 了解细胞器分离的基本原理，掌握操作方法

二、实验原理

1. 细胞器的分离

细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成，细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等，这些也称作亚细胞组分。对于细胞的结构和功能的研究，是细胞生物学的基本课题，其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。

差速离心主要适用于分离密度和大小有显著数量级差别的颗粒，也适用于分离细胞器。差速离心是细胞器分离最常用的方法。对于精细的分部分离，则密度梯度离心效果更好，但制备介质梯度比较耗时。

差速离心法：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替的方法进行离心，是沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度和离心时间下分批分离。差速离心方法细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体，最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗

粒裹到沉降块中，一般离心时重复2~3次效果会好一些。

三、试剂与器材

1、材料：菠菜叶片。

2、试剂：

(1) PBS溶液；

(2) GR buffer：2mM EDTA(pH8.0)，1mM MgCl₂·6H₂O ，1mM MnCl₂·4H₂O，50mM HEPES-KOH(pH8.0)，0.33M山梨醇，0.5g/L BSA，使用前加入5mM抗坏血酸钠；

(3) 1*SH buffer：0.33M山梨醇，50mM HEPES-KOH(pH8.0)。

3、实验器材：

解剖刀、剪刀、玻璃漏斗、玻璃匀浆器、尼龙织物、离心管、高速冷冻离心机、显微镜载玻片、盖玻片、吸水纸、恒温水浴锅等。

四、实验内容

1. 完整细胞中的叶绿体观察

用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴PBS缓冲液，加盖片后轻压，镜检观察。

2.植物叶绿体的分离提取：

(1) 将菠菜叶洗净，吸水纸吸干水后，取叶脉，称取5g鲜重的叶片，剪成碎片；

(2) 放入研钵中，加入25 mLGR buffer抽提液，用研钵迅速研磨3-5 min，匀浆液用四层纱布过滤，将滤液收集于预冷的50mL离心管中。把滤出的残渣重新放回研钵中，加新鲜的抽提缓冲液10 mL，再次研磨，收集并合并滤液；

(3) 4℃ 2600g离心5 min，弃上清，留沉淀；

(4) 向沉淀中加入1*SH buffer后用毛笔轻轻重悬沉淀，后4℃ 2400 g离心5 min，弃上清，留沉淀。重复此步骤一次；

(5) 沉淀即为叶绿体，镜检叶绿体的完整性和纯度。

五、关键步骤及注意事项

1. 注意掌握差速离心的时间和速度，注意低温操作，匀浆时充分破碎组织时间不宜过长。

六、思考题

1.离心结束时亚细胞组分在介质中各呈什么样的分布？因而收集组分的方法有什么分别？

2. 绘制叶绿体镜检结果。

实验八 氧电极法测定植物的光合和呼吸速率

一、实验目的

1. 了解氧电极法测定的基本原理。

2. 掌握氧电极法测定植物线粒体和叶绿体的呼吸速率的方法。

二、实验原理

氧电极实际上是一个电化学电池，由镶嵌在绝缘材料上的银极和铂极构成(下图)。银极为阳极，一般制成圆环状，作为参比极，银极的面积要尽可能大些，以降低电极表面的电流密度，减少阳极的极化现象，使其电极电位不受外加电压的影响。铂极为阴极，一般制成圆点状，位于银极的中央，电解反应即发生在铂极上。

在电极的表面用15～20μm的聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜覆盖，在电极与薄膜之间充以氯化钾溶液作为电解质。由于水中溶解氧能透过薄膜而电解质不能透过，因而排除了被测溶液中各种离子电解反应的干扰，成为测定溶解氧的专用性电极。

当在氧电极两极间施加电压并超过O₂的分解电压(约为-0.2V)时，透过薄膜进入氯化钾溶液的溶解氧便在铂阴极上还原：O₂+2H₂+4e^-= 4OH^-

银阳极上则发生银的氧化反应：4Ag+4Cl^-= 4AgCl+4e

此时电极间产生电解电流。由于氧在阴极被还原，而使阴极表面氧的浓度降低，于是被测溶液中的溶解氧便向阴极扩散补充，使还原过程得以继续进行，又由于电极反应的速度极快，而氧分子的扩散速度则较慢，所以电解电流的大小受氧的扩散速度的限制。这种受氧扩散速度限制的电解电流叫做扩散电流。在溶液静止、温度恒定的情况下，扩散电流受被测溶液与电极表面O₂的浓度差控制。随着外加电压的加大，电极表面O₂浓度必然减小，被测溶液与电极表面O₂的浓度差加大，扩散电流也随之增大。但当外加的极化电压达到一定值时，阴极表面氧的还原速率大大超过O₂向阴极的扩散速率，使阴极表面O₂的浓度趋近于零，于是扩散电流的大小完全取决于被测溶液中的氧的浓度(对于薄膜氧电极而言，也就是紧靠膜外侧的O₂浓度)。此时再增加极化电压，扩散电流基本上不再增加，使极谱波(即电流-电压曲线)产生一个平顶。将极化电压选定在平顶的中部(约0.6～0.9V)，可以使扩散电流的大小基本不受电压微小波动的影响。即电压在0.6～0.9V之间，氧电极输出的电流与电极外面氧浓度之间有良好的线性关系。因此，在极化电压及温度恒定的条件下，扩散电流的大小即可作为溶解氧定量测定的基础。电极间产生的扩散电流信号可通过电极控制器的电路转换成电压输出，用自动记录仪进行记录。

三、实验用品

1.器材：普通离心机，粗天平，荧光显微镜，剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管，10mL刻度离心管，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片。

2.材料：新鲜菠菜。

3.试剂：半饱和KCl溶液，连二亚硫酸钠

四、实验步骤

a.氧电极的安装

1. 电极清洁

安装电极之前必须用清洁剂清洁电极。(1)用棉棒蘸少许电极泥，反复擦拭氧电极底部的银极(阳极)，直到电极表面的氧化层被擦掉，电极光亮为止。(2)用蒸馏水冲洗电极，将电极表面的电极泥冲掉，然后用吸水纸吸去电极表面的水。

2. 电极膜的安装

(1) 在圆形电极(即中间铂极)的顶部加一滴半包和氯化钾溶液，再往两边银极相对应的地方各滴一滴半包和氯化钾溶液。

(2) 剪盐桥纸。顺着宽度剪一条4~5mm宽的盐桥纸(注意弃掉盐桥纸发亮的地方)，再搭在电极上，盐桥纸中心部位覆盖在铂极上，两端与银极接触，担当盐桥的作用。

(3) 放电极膜，主要目的是覆盖铂极，只允许氧分子通过。剪一块正方形的电极膜，覆盖在盐桥纸片上面，膜内不能存有气泡。

(4) 加放“O”型圈。将电极的“O”型圈放在装膜器的末端，然后将装膜器垂直于圆形电极的顶部，向下滑动装膜器的外套，推动“O”型圈套在覆有电极膜的电极上。

b. 氧电极系统的安装

(1) 电极膜装好后，检查铂极附近无气泡，褶皱。放好大密封圈，将电极装入反应室中，旋紧底座，注意不要旋的太紧，太紧会造成电极膜的拉伸，太松会导致下部密封不严。

(2) 电极室安装好后，从反应室顶部开口处往里放小磁针。

(3) 将电极和电极连线(一根黑色的线)连接好。

(4) 将安装好的电极室装到控制盒的磁力搅拌器上。

(5) 连接电源，连接USB连接线，与电脑接通。

c. 测试电极安装是否完好

(1)打开电脑软件Oxytrace。

(2)向电极室中加适量水，鼠标点开工具栏中第八个图标(绿色圆圈圈)，转子开始转动。点图标“go”，再关掉转子，若信号线迅速下降，再开转子，信号线迅速上升，则意味着电极安装没问题。

d. 氧电极的校正

校正前在反应室中定量加入一定体积的氧饱和的水(蒸馏水，敞口，搅动后静置半小时，即为氧饱和水)，建议1ml，给反应室顶端加放盖子，至漏斗最顶端接触液面。点击Calibrate→Liquid Phase Calibration→Air Saturated Water。

(1)输入温度和大气压，点击“Ok”进入下一步。(温度为循环水浴的温度，若无循环水浴则设为室温；输入本地大气压，平原地区可直接输入标准大气压。)

(2)输入转子转速，点击“Ok”进入下一步。(100为转子转速的百分数，100%=900转/min)。

(3)等信号线到稳态后，“Override”自动变为“Ok”，点击“Ok”进入下一步。

(4)建立零氧线。切记先不要着急点“Ok”。向反应杯中加入现配的保险粉溶液(向1.5ml EP管中加大约半个绿豆粒大小的连二亚硫酸钠，加水至满，上下颠倒混匀)，直接拿开反应室盖子，加入约1/3保险粉溶液，信号线则快速下降到0附近。点击“Ok”进入下一步。

(5)等信号线到稳态后，“Override”自动变为“Ok”，再点击“Ok”，即弹出对话框，点击“Save Calibration”，保存校正结果，校正完成。(Calibration factor为校正因子，Calibration offiset为校正补偿)

(6)校正结束后，由于反应室中含有高浓度的耗氧剂，用蒸馏水清洗反应杯5~6次，将反应室中的耗氧剂清洗干净，然后加入一定体积的蒸馏水，建议和校正时体积一样。

(7)测试校准效果。点“Go”运行，如果溶解氧值显示为直线，表明校准结果良好。

e. 样品测定

(1) 开始测定前，调整软件坐标轴，点击“Graph”→“Zoom XY”，弹出对话框，设置Y轴和X轴的数值，Y轴一般不需设定，X轴建议设定为0~10min，可根据实验需求自行调整。

(2) 样品测定前，将样品放在循环水浴锅中温浴一段时间，使得样品温度同测定温度。

(3) 将样品放入反应杯中，盖上反应杯盖，点击“Go”开始实验，仪器软件上会显示一条氧气信号线，实验完毕后点击“Stop”停止实验记录。(氧气踪迹线下降，表示反应为耗氧反应，反应速率为直线的斜率)。

(4) 取斜率。点击从左往右数第16个图标，弹出对话框，在氧气信号线上选取一段比较贴合直线的区段，范围尽量取大一点。点击右键→“Add rate to table”。弹出对话框，显示所选区段的斜率。

(5) 保存数据。点击“File”→“Save”，弹出保存对话框，输入文件名，将数据保存在电脑上。

五、注意事项

(1) 安装电极时注意不能用剪刀，镊子等尖锐的物体划伤电极；

(2) 冲洗电极时注意不能把水尤其是KCl溶液溅到电极和电极连线接口处；

(3) 氧电极对温度非常敏感，测定时应注意温度一致；

(4) 测定破碎组织时，碎块应均匀一致，不宜过大；

(5) 磁砖子非常小，使用时防止丢失；

(6) 测定加样时，防止进入气泡，气泡会造成信号不稳定；

(7) 准确加入反应体系的体积，反应体系体积参与最终计算；

(8) 保险粉要现用现配；

(9) 更换反应液时要用塑料吸管，玻璃吸管容易戳破电极膜；

(10) 建议装好的电极连续使用时间不能超过24小时；

(11) 连接循环水浴锅时，水浴锅要良好接地；水浴锅循环水从氧电极反应室的下口进上口出；

(12) 特别注意用有机溶剂清洗反应杯时不能伤害反应室；

(13) 开启控制盒电源前，确定所有的连接都已连接好。

六、结果与分析

氧电极法测定植物呼吸速率和光合速率结果

实验九 植物细胞Feulgen染色观察